การย้อมฟิล์มเลือด (Staining Blood Film)
Giemsa stain
สี Giemsa มีจำหน่าย 2 รูปแบบ คือ ชนิดที่เป็นสารละลาย (concentrated stock solution) และ ชนิดผง (powder) ซึ่งแบบผงนี้เหมาะสำหรับผู้ที่ต้องการเตรียมสีย้อมเองในห้องปฏิบัติการ เนื่องจากสีที่เตรียมจาก stock solution และชนิดผง มีความแตกต่างกันน้อยมาก การเลือกใช้ชนิดใดจึงขึ้นอยู่กับความพอใจของผู้ใช้
การย้อมฟิล์มเลือดหนาและบาง

อุปกรณ์

- Measuring cylinder ขนาด10,50 และ100 ml.
- Beaker ขนาด 50 และ 250ml.
- Staining jar
- Slide forcep
- Slide rack
- นาฬิกาจับเวลา
- Giemsa stain
- Methanol
- Buffered water

ภาพที่ 14 แสดงอุปกรณ์ที่ใช้ในการย้อมฟิล์มเลือดหนาและบาง  
 
A. การย้อมฟิล์มเลือดจำนวนน้อยกว่า 10 แผ่น
หลักการ
- ฟิล์มหนาย้อมได้ทันทีไม่ต้อง fix
- ฟิล์มบาง fix ก่อนย้อมใน methanol 2-3 นาที และทิ้งให้แห้ง
1. เตรียมสี Giemsa (working solution) ที่จะใช้ย้อม โดยทำการเจือจางสีใน buffered water ดังนี้
- Giemsa stock solution : buffered water (pH 7.0-7.2) = 1:20 (ใช้ย้อมฟิล์มบาง)
- Giemsa stock solution : buffered water (pH 7.0-7.2) = 1:50 (ใช้ย้อมฟิล์มหนา)
2. ผสมสีให้เข้ากันใน cylinder ด้วยแท่งแก้วสำหรับคน
3. วางสไลด์ที่จะย้อมลงบนแท่งแก้วที่วางพาดไว้บนถาด หรือ อ่างน้ำ สำหรับย้อมสไลด์ เทสี Giemsa (working solution) ให้ท่วมฟิล์มเลือด
4. ฟิล์มเลือดบางใช้เวลาย้อมประมาณ 20 นาที
ฟิล์มเลือดหนาใช้เวลาย้อมประมาณ 40-50 นาที
5. ล้างสีออกด้วย buffered water หรือน้ำประปา
(อย่าเทสีออกจากสไลด์แล้วล้างน้ำ เพราะจะทำให้เกิดตะกอนบนสไลด์
ควรเทน้ำลงบนสีที่ท่วมสไลด์เพื่อล้างสีออก
)
  ภาพที่ 15 แสดงการย้อมฟิล์มเลือด
ชนิดหนาและบาง จำนวนน้อย
6. วางสไลด์ใน rack ในลักษณะเอียงทำมุม (ดังภาพ)
ทิ้งไว้ให้แห้ง
  ภาพที่ 16 แสดงการวางสไลด์ที่ให้แห้ง
ในอุณหภูมิห้อง
7. นำสไลด์ที่ย้อมสีแล้วไปตรวจดูเชื้อปรสิตด้วยกล้องจุลทรรศน์
  ภาพที่ 17 แสดงฟิล์มเลือด
ชนิดหนาและบาง ที่ย้อมสีเรียบร้อยแล้ว
B. การย้อมฟิล์มเลือดจำนวนมาก
1. ใช้ forcep คีบสไลด์ทีละแผ่นวางลงใน staining jar สำหรับย้อมสี วางสไลด์ในลักษณะ Z pattern
ดังภาพ A B
ภาพที่ 18 (A, B) แสดงการวางสไลด์ในลักษณะ z -pattern
2. เทสีลงไปจนถึงระดับที่สีท่วมสไลด์ ปิดฝา staining jar แล้วตั้งทิ้งไว้ 30 นาที ในที่ๆ ไม่มีแสงแดดส่องถึง
3. เปิดฝา staining jar ค่อยๆ เทน้ำสะอาดจาก beaker ลงไปเพื่อล้างสีที่ตกค้างบริเวณผิวส่วนบนออกไป
4. ค่อยๆ เทสีทั้งหมดออกจาก staining jar (ในกรณีที่จะเก็บสีไว้ใช้ ก็สามารถทำได้ แต่จะต้องใช้ย้อมภายในวันที่เตรียม เนื่องจากสี Giemsa working solution มีอายุการใช้งานเพียง 1 วัน)
5. เติม buffered water ลงไป
  ภาพที่ 19 แสดงการย้อมฟิล์มเลือด
ชนิดหนาและบาง จำนวนมาก
6. ใช้ forcep คีบสไลด์จากที่ย้อมทีละแผ่น จุ่มสไลด์แต่ละแผ่นลงใน beaker ซึ่งมีน้ำเปล่าบรรจุอยู่ โดยจุ่มลงไปเบาๆ เพื่อไม่ให้ฟิล์มเลือดที่ย้อมสีแล้วหลุดออกไป
7. วางสไลด์ในลักษณะเอียงบน rack ทิ้งไว้ให้แห้ง โดยเอาด้านฟิล์มเลือดคว่ำลง เพื่อป้องกันฝุ่นละอองในอากาศ
8. นำสไลด์ที่แห้งแล้วไปตรวจดูด้วยกล้องจุลทรรศน์
  ภาพที่ 20 แสดงการจุ่มล้างสไลด์
ลงใน beaker
ผลการย้อมด้วย Giemsa stain
การติดสีของเม็ดเลือด
  - erythrocytes - pale red
- nuclei of white blood cells - purple with pale puple cytoplasm
- eosinophilic granules - bright purple - red
- neutrophilic granules - deep pink – purple
การติดสีของเชื้อมาเลเรีย
  - cytoplasm - blue
- nuclear material - red to purple - red
- Schuffner’s dots and other inclusions in the RBCs - red
การติดสีของเชื้อ Babesia spp., trypanosome และ leishmaniae
  - nuclear material และ cytoplasm เหมือนกับเชื้อมาเลเรีย
การติดสีของ microfilaria
  - sheath - ไม่ติดสี Giemsa
- nuclei ภายในตัวmicrofilaria - blue to purple
ภาพที่ 21 แสดงเชื้อมาลาเรียชนิด
Plasmodium falciparum
ระยะ ring form
ภาพที่ 22 แสดงเชื้อมาลาเรียชนิด
Plasmodium vivax
ระยะ growing trophozoite
ภาพที่ 23 แสดงเชื้อ microfilaria ในฟิล์มเลือดที่ย้อมด้วยสี Giemsa
ภาควิชาปรสิตวิทยา คณะแพทยศาสตร์ จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย